MgCl2在PCR中的作用是什么?
聚合酶链式反应(PCR)基础
你知道吗?穆里斯和迈克尔·史密斯获得了诺贝尔奖因为他在1983年发现了聚合酶链反应(PCR) ?
这项突破性的技术使科学家能够在短短几小时内将一条DNA链增殖上千亿次。这个实验所需要的只是试管、一些化学物质和加热。如果没有聚合酶链反应，对生物基因组的分子和基因分析将是不可能的。
这在体外工具是必不可少的一系列生物实验室，包括分子生物学，植物生物学，动物学，和03manbetx.com 以扩增一小段DNA。由此产生的PCR产物被用于其他实验室工作流程，如DNA指纹或遗传分析。(你还知道吗人类基因组计划涉及到PCR的使用?)
PCR通常被称为“分子表现型”，今天，几种PCR方法用于不同的目的，包括RT-PCR、Real-Time PCR、多重PCR和热启动PCR。
PCR的阶段
不考虑不同类型的PCR，所有的包括三个基本阶段：
- 变性阶段:这一阶段也称为核酸变性。在这里，在95°C的温度下加热DNA模板，通过破坏氢键使其螺旋结构变性为两条单链。
- 退火阶段:在50 - 65°C(称为退火温度)下，引物与单链模板DNA结合。
- 伸长/扩展阶段:在这个阶段，新的DNA链开始合成。温度设定在72°C-74°C之间，Taq DNA聚合酶(在PCR反应中主要使用DNA聚合酶)与引物结合并使用dNTPs(脱氧核苷酸三磷酸)形成新的DNA。
PCR所需试剂
进行aPCR分析包括DNA模板(可以是基因组DNA、质粒或cDNA)，DNA聚合酶引物，dntp (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)和PCR缓冲液，包括tris-HCL, KCL和MgCl2．
反应混合物的所有这些成分都以不同的方式影响PCR反应，因为它们都协同工作，为感兴趣的基因复制数百万个扩增子。
在本文中，您将了解MgCl的作用2它是如何促进这个过程的，以及它的浓度变化是如何干扰你的反应的。
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MgCl的作用是什么2在PCR反应中?
MgCl2(氯化镁)是一种必不可少的成分PCR主混合．它作为辅助因子，增强DNA聚合酶的酶活性，从而促进DNA扩增。
辅因子是非蛋白质离子或者是帮助酶发挥作用的分子。因此，缺乏这些辅助因子将使酶死亡完全不执行任何功能．这些辅助因子可以是带正电的金属离子(如锌、铁或镁离子)或小碳基分子(如维生素B12)。
看看这些更好地理解的例子辅助因素的作用:
- 参与糖酵解和柠檬酸循环的丙酮酸脱氢酶，没有它的辅助因子，包括TPP, FAD, NAD，就不能工作+CoA和Mg2 +．
- 碳酸酐酶，一种对维持我们身体pH值有作用的酶，在缺少辅助因子锌离子的情况下无法发挥作用。
除了增强DNA聚合酶活性外，MgCl2也有利于PCR反应过程中引物在特定位点的结合。
MgCl如何2工作吗?
MgCl2两者都有促进作用吗Taq DNA聚合酶引物对模板DNA/RNA链的活性和退火特异性。
MgCl的分子机理2增强Taq DNA聚合酶活性
Mg2 +在PCR扩增过程中利用氯化镁的离子(或镁离子)，以促进Taq DNA聚合酶的催化活性。
但它是怎么做到的呢?
在PCR扩增过程中，Mg2 +离子与dNTP的α磷酸基团结合，促进β和γ磷酸的去除。由此产生的dNMP通过磷酸基与相邻核苷酸的3 ' OH(羟基)形成磷酸二酯键。
MgCl2的作用促进引物结合
Mgcl2通过影响底漆熔化温度(Tm)，帮助底漆在特定位置的结合。
Tm定义为DNA双链的一半解离成单链的温度，表明双链的稳定性。
的MgCl2增加PCR反应的Tm，使引物和模板DNA之间的相互作用更好。MgCl中的镁离子2与DNA中带负电荷的磷酸离子结合，减少两条DNA链之间的静电斥力。这将导致引物与其互补的DNA链进行适当的退火。
镁过多或过少的影响
MgCl2对PCR协议的优化至关重要。需要一个最佳的试剂量来创造适当的PCR条件，以适当地扩增所需的DNA/RNA模板片段。
PCR缓冲液中含有足够数量的氯化镁，可以支持正常的PCR反应。然而，什么是“适量的氯化镁指什么?
对于标准的PCR反应，1mm到5mm MgCl2使用。然而，2mm MgCl2是缓冲制剂最常用的浓度。
即使知道了最佳用量，也需要优化MgCl的最终浓度2你的反应，因为它的变化取决于PCR条件。例如，对于GC含量高的DNA模板，或在使用不合适的引物时，浓度高于2 mM的MgCl2可能需要。
增加MgCl也是必要的2当试图补偿含有PCR抑制剂的DNA提取物时的浓度，因为它们也与Mg结合2 +离子和减少它们的可用性。
此外，你必须注意过多或过少的MgCl2也会影响你的反应。
- MgCl过量2：在PCR反应中，氯化镁的过量会导致引物的非特异性结合，导致DNA复制错误。因此，琼脂糖凝胶电泳可以显示更多的DNA条带。
在某些情况下，较高的MgCl2浓度也可能导致引物二聚体的形成。
- 氯化镁过少2：在这种情况下，引物将不能与DNA模板碱基对，导致弱扩增或完全PCR失败。
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MgCl2是制备PCR缓冲液的重要原料之一。它与提高Taq DNA聚合酶的催化活性和促进引物结合有关。
进一步研究了MgCl的最佳浓度2在进行正常的PCR时，它是必要的，因为过多或过少的它会降低PCR的产量。
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