PCR系统如何工作&我们如何节省您的时间和金钱

Real-time PCR是通过配备荧光检测模块的专门热循环仪实现的，该热循环仪在发生扩增时监测荧光。这种方法被称为实时PCR (real-time PCR)或qPCR (quantitative PCR)。

与传统的PCR方法不同，该方法最重要的区别是PCR产物(扩增的DNA)可以实时检测(在扩增过程中)，而不是在PCR后的步骤中，需要使用琼脂糖凝胶进行检测和可视化。另一个关键的区别是qPCR可以定量和特异性。例如，一个感兴趣序列的起始量可以通过将样本与已知DNA量的标准曲线进行比较来确定

为了增加其特异性，将TaqMan探针引入qPCR。原理上，这些探针依赖于Taq聚合酶的5 ' -3 '外切酶活性，在杂交过程中将双标记探针切割到互补的目标序列，随着反应的进行，使用基于荧光团的检测方法检测和定量特定的PCR产物。

定量PCR技术已经被设计用于支持广泛领域的许多应用，包括基因表达分析、基因分型和microRNA分析(miRNA)。

在购买实时PCR热循环仪时，应考虑的因素包括占地面积、多路复用能力、与标准液体处理工作站和多通道移液管的兼容性、试剂和消耗品成本、易用性、软件功能和吞吐量潜力。

从经济的角度来看，随着多年来技术的迅速改进，我们已经看到qPCR机器成本的下降，使这些设备更容易被实验室社区获得。

用于基本PCR的DNA聚合酶需要DNA模板。然而，在许多情况下，RNA扩增是首选。要研究RNA，样本必须首先使用逆转录酶将其逆转录为互补的(c)DNA。

得到的cDNA可以作为后续聚合酶链反应扩增的模板。利用cDNA模板进行的特异性PCR技术称为逆转录PCR，即RT-PCR。这种方法不要与实时荧光定量PCR (real-time PCR，也称定量PCR (qPCR))混淆。

RT-PCR的第一步包括合成DNA/RNA杂交体。逆转录酶也有一个核糖核酸酶(核糖核酸酶H)功能，它可以降解杂交体的RNA部分。单链DNA分子然后由DNA依赖的DNA聚合酶活性的逆转录酶完成为cDNA(互补DNA)。需要注意的是，第一链反应的效率会影响扩增过程。

然后，用标准PCR程序扩增cDNA。利用RT-PCR将RNA转化为cDNA的可能性有很多优点。然而，RNA是单链的，非常不稳定，这使得它很难研究。它是qPCR的第一步，qPCR可以量化生物样本中的RNA转录本。RT-PCR通常用于基因表达谱分析，将真核基因插入原核生物，以及疾病诊断。

与qPCR相比，数字PCR (dPCR)设备可以提供精确、灵敏和可重复性的目标核酸绝对计数定量结果。因此，dPCR有可能对临床和研究和应用中的分子分析产生重大影响。

这包括生物标志物分析、病毒检测、预后监测和胎儿筛查，以及噬菌体-宿主相互作用和细胞内图谱。dPCR也可用于协助大规模并行下一代测序方法所需的文库准备。

传统的PCR只提供终点分析，需要在PCR后进行二次扩增，这使其成为半定量，而dPCR(类似于qPCR)提供绝对定量。然而，与qPCR不同，dPCR不需要参考文献或标准。

此外，它还提供了一个独特的样品分划步骤，即在扩增之前将PCR反应分划到数千个单独的反应容器中。这使得该技术在qPCR能力的基础上具有很高的灵敏度和精确性。

这些特点使数字PCR非常适合于需要少量核酸检测或样品中靶量分辨率更高的应用，包括罕见序列检测、拷贝数变异(CNV)分析和罕见靶的基因表达分析。

另一种进行数字PCR的方法是液滴数字PCR (ddPCR)，它利用Taq聚合酶在复杂样本中扩增目标DNA。此外，它使用微流体技术在油中乳化样品，产生可重复的液滴，并通过荧光技术进行处理和分析。

在ddPCR过程中进行分析之前，使用水乳液滴技术将样品分成20,000个液滴，进行热循环，然后通过96孔PCR板。在这个过程中，每一个液滴被分析，以确定使用泊松统计。

该分析确定了原始样品中pcr阳性液滴的数量。然后使用泊松统计进一步分析这些数据，泊松统计确定了原始样本的目标DNA浓度(绝对计数)。

如上所述，将样品分成数千个反应容器是数字PCR和和qPCR的主要区别。然而，由于其实用性和可扩展性，ddPCR被认为比早期的数字PCR方法更先进。

ddPCR的方法是最先进的检测技术，因此，它也是人们可以选择的最昂贵的购买。

遵循传统PCR相同的原理，热启动PCR使用DNA聚合酶从单链模板合成DNA。然而，这里的主要区别是热启动包括额外的加热和分离设置。

这包括用特定的抗Taq抗体和其他各种机制，如化学修饰和适配体技术，在低温下阻断Taq聚合酶的活性。

通过包括这些方法，热启动PCR减少了非特异性引物/扩增和引物二聚体的产生。此外，它还通过提高产物产量、特异性和敏感性来提高PCR性能。

与传统方法不同，传统方法在一个反应孔中扩增单个目标，多重PCR允许在一个反应孔中同时检测多个目标。这是通过使用多个相互区分的引物来实现的。

通过同时扩增多个片段，而不是单个扩增，实验室可以从多重PCR中大大受益，节省空间、时间和试剂。此外，它需要少量的DNA作为起始模板，可以在DNA质量较差的标本上进行。

尽管有其好处，多重PCR优化是具有挑战性的。当使用多个引物对时，一对引物可以与另一对引物相互作用。因为每一对引物都有不同的需求，所以没有最佳熔化温度和自由能变化量G。

多重PCR通常用于各种研究应用。这包括基因面板表达、SNP基因分型、病原体检测、模板量化等。

与数字PCR相似，嵌套方法减少了目标序列非特异性扩增的机会。这是由于嵌套式PCR使用了针对同一目标段的多个引物集和两个连续的PCR反应。

第一组引物将在第二组引物之前退火到序列，嵌套，引物集，这样做将放大一个大的基因片段，然后在第二次PCR反应期间用作模板。第二轮的目标是一个小得多的扩增子区域——染色体DNA的片段，已经进行了扩增并包含复制的DNA——使用嵌套引物集。

传统的引物是一个接一个的添加，为了应对污染和特异性下降的挑战，采用了单管嵌套PCR反应。

嵌套PCR虽然极其敏感，但存在污染风险，运行成本也很高。尽管如此，这项技术已经被证明对实验室扩增和检测丰度低的基因有价值。