核酸提取和纯化以及我们如何节省您的时间和金钱

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核酸提取和纯化是跨分子生物学,生物药物,生物技术和各种医学科学的研究中使用的基本关键方法。
核酸样品制备包括广泛的提取和纯化技术,用于将样品从不能直接分析的样品转换为可以的样品,从而适合下游进行分析技术的特定要求。在计划进行定量和定量核酸时纯化和提取样品非常重要。
That’s because purity and yield of the extracted nucleic acids is critical to performance in those downstream applications, which include polymerase chain reaction (PCR)—more specifically, real-time PCR (qPCR)—as well as reverse transcription PCR (RT-PCR) and sequencing. In clinical and research laboratories today, RNA, DNA, and total nucleic acids (total RNA and DNA) are isolated and extracted through both manual and automated techniques.
手动提取需要多个步骤,增加污染的风险。它也被认为是高度复杂的,因此并非每个实验室技术人员都能手动进行提取和纯化。
话虽如此,手动提取的另一个缺点是整个过程非常耗时且劳动力密集,需要技术人员的注意力。
另一方面,自动提取比更传统的手动方法具有许多好处。最重要的是分离的核酸的一致性。样品操纵和试剂的使用减少,大大降低了交叉污染的机会。
此外,自动化仪器和系统降低了提取和纯化的总体复杂性,使得测试更容易由更多的科学家执行。
尽管自动提取工具比手动方法具有许多好处,但每次测试的成本可能大大高于手动方法。自动化通常仅在需要样品的高吞吐量时才有意义。
了解您和您的团队的确切样品准备需求是确定哪种方法(无论是手动还是自动化)以及哪种仪器的重要步骤,以及哪种仪器适合您的实验室。
下面我们将介绍一些可用的技术和表征方法,以及DNA纯化的基础。
提取和纯化方法

核酸提取和纯化是无数下游应用的重要第一步,因为高质量,高纯的DNA和RNA在各种研究和临床应用中很重要。可以使用手动或自动化方法进行提取和纯化。我们将介绍以下这些方法的基本步骤。
手动核酸分离
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手动方法在很大程度上依赖于结合化合物。最终的过程是非常耗时的,需要在每个步骤中引起实验室技术人员的关注。交叉污染的风险也增加。同样,这些方法中的大多数都需要重复的离心步骤,然后根据样品的类型和其他机械处理去除上清液。
通常,基本的提取方法包括四个步骤:
- 细胞裂解,以破坏细胞/组织
- 核蛋白复合物的变性
- RNA/DNA核酸酶的灭活(RNase for RNA提取和DNase用于DNA提取的DNase)
- 避免污染
一种常见的方法是将硫氰酸硫苷,苯酚,氯仿和乙醇组合使用来分离和提取靶核酸,从而去除蛋白质和盐的杂质与核酸的杂质。这为整体过程增加了多个分离和纯化步骤,例如重复离心。
另一种方法涉及碱性裂解,可用于分离质粒DNA。这与细菌培养基(例如大肠杆菌)很好地配合使用,并使用十二烷基硫酸钠(SDS)通过与硫酸盐涂层涂层DNA诱导DNA的碱性变性。然后在离心后回收质粒DNA。
传统的提取方案和方法通常太难定期使用。而且,由于提取和纯化是生物学研究和临床诊断的重要组成部分,因此所使用的方法已被简化。
实际上,简化的需求导致了多种半自动方法的发展,例如固相核酸纯化,可作为提取试剂盒获得。
该方法包括基于自旋柱的核酸纯化,这种方法可以迅速将核酸二氧化硅作为固相 - 以及可通过众多制造商获得的纯化试剂盒,使科学家能够加快纯化过程,从而导致纯化过程更有效的提取程序。它涉及四个类似但简化的步骤:
- 细胞裂解破坏细胞/组织
- 核酸吸收
- 避免污染的同时洗涤
- 洗脱
这种半自动化的方法使用各种物质进行纯化,最常用的是二氧化硅矩阵(这些材料包括二氧化硅和玻璃颗粒以及玻璃粉末和纤维),磁珠和阴离子 - 交换树脂。
实际上,使用磁珠本质上是将过滤,离心和分离为单个纯化步骤。
基于磁珠的核酸纯化,也称为基于粒子的纯化,是一种结合洗脱过程,其中靶核酸与珠子结合并洗涤,并最终与其他核酸或杂质分离展示。
这是使用由磁分离架施加的磁场进行的,该磁场将结合的核酸从水溶液中存在的其余污染物中拉开。它类似于基于二氧化硅的方法,该方法也使用结合洗脱过程。
除了纯化之外,这些半自动化的提取过程和商业套件通常遵循一系列复杂的步骤,需要类似的工作才能获得较低的收益,就像手动方法一样)。
因此,已经开发了自动化的高通量系统。重要的是要考虑您的实验室是否可以从这种系统中受益。
自动核酸分离
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由于制造商(如Thermo Fisher Scientific和Qiagen)提供的自动提取系统的发展,DNA和DNA隔离的提取已得到加速。
这些系统极大地简化了整个提取过程,并允许无需进行专业培训而进行高通量。实际上,这些自动化系统提供的易用性意味着您和您的团队培训较少。
自动化系统不仅会降低所需的工作时间和人工成本,还可以提高核酸提取和纯化的安全性,质量和可靠的高收率。
但是,要使用手动提取方法竞争,自动化系统必须满足几个要求:可再现的结果,最小的交叉污染,易用性和高质量的下游测试,以及技术人员必须花费的时间大幅度减少与乐器。
使用自动系统时涉及三个主要步骤:
- 将试剂添加到液体样品中
- 将套件使用的墨盒放入机器中
- 开始您的过程
自动化仪器倾向于利用固相核酸提取中使用的相同试剂盒,但会大大减少完成该过程所需的时间和精力。与过去的手动方法相比,科学家认为自动化系统使核酸提取和纯化变得更简单,更快和准确。
自动化系统最成功的例子是自动化液体处理程序,这些液体处理程序通常在许多生命科学和临床分析实验室中用于将样品,试剂或其他液体分配给指定容器的精确量。
使用固相或磁珠方法开发了完全自动化的核酸提取方案,但是,在某些情况下,由于降解的核酸靶标可能会丢失,因此在某些情况下,高通量可能会损害总体敏感性。
基因组与质粒DNA分离
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除了手动和自动核酸提取方法之间的差异外,还有其他一些重要区别。具体而言,基因组DNA分离和质粒DNA分离之间的区别。
基因组DNA分离需要强裂解以将基因组DNA释放到溶液中。这意味着进行细胞膜的酶促分解或机械分解。如果使用酶进行细胞破坏,则通常使用蛋白酶K和溶菌酶。
机械故障通常涉及在涡旋上使用珠子跳动。之后,使用诸如氯仿提取的方法来实现DNA纯化,其中苯酚/氯仿用于清洁脂质双层,蛋白质和其他细胞碎屑。
相比之下,质粒DNA分离通常需要轻度碱性裂解,以便将质粒DNA与基因组DNA一起进入溶液中。
另外,在基因组DNA分离和细胞裂解之后,基因组DNA可以从脂质膜和蛋白质中纯化。另一方面,在质粒DNA分离过程中,用乙酸钾中和将与基因组DNA分离质粒DNA。
全血样品类型是用于获得DNA的主要来源之一,并且有许多不同的方案可在此类样品上进行核酸提取。
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提高准确性和速度的需求将自动化的重要性推向了生命科学和分子生物学的最前沿。
由于COVID-19大流行等事件,实验室升级了人类干预措施和实验室效率的提高,实验室正在努力开发诊断和治疗剂来对抗病毒,同时必须与有限数量的科学家和技术人员一起进行。
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提取和纯化系统制造商和型号
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Thermo Fisher科学:
翠鸟纯化系统,翠鸟二重奏,翠鸟屈曲,翠鸟普雷斯托
哈德逊机器人:
DNA提取系统(DNA,RNA和蛋白质)
Bioneer:
外生物学
Tecan:
自由EVO,自由EVO NAP工作站,自由EVO 75配置,自由EVO HSM工作站
Perkinelmer:
Chemagic Systems,Chemagic 360,Chemagic Prime,Chemagic Prime Junior,Chemagic Prepito,LabChip GX Touch 24,LabChip GX Touch HT,LabChip GXII Touch HT
普罗梅加:
Maxwell 16系统,Maxwell RSC仪器,Maxwell RSC 48乐器,Maxwell CSC仪器,Maxwell CSC 48仪器,Maxwell FSC仪器,Maxwell 16仪器,Maxwell 16法医仪器
Biosan:
Biomagpure 12
Bio-Rad:
智商检查准备解决方案
勒符
安全Sens:
BCSI快照
RBC生物科学:
MAGCORE系统,Magcore HF16,Magcore HF16 Plus,Magcore HF48,Magcore Super Super
Elitech Group:
精英之星
Shimadzu:
Perfinity Workstation,Perfinity IDP
Biochrom:
生物色素30+
GenerEach:
Taco,Taco Mini,Pockit,Pockit Xpress,Pockit Combo,Pockit Micro Series,Pockit Micro,Pockit Micro Plus,Pockit Micro Duo,Pockit Central
Autogen:
QuickGene,QuickGene-Auto 12s,Quick-Mini 8L,QuickGene 810,QuickGene 610L,QuickGene-Mini80,Flexstar+,Flex Star,Gene Prep,Gene Prep,Autopure
Qiagen:
Qiacube
生物链:
Anaprep 12
吉尔森:
Verity,Verity Plc,Verity Plc-MS系统,Verity Oligo,Verity GPC清理系统
罗氏生活科学:
Magna Pure系统,Magna Pure 96系统,Magna Pure 24系统,Magna Pure LC 2.0系统,Magna Pure Compact System
Taigen:
Labturbo 96XC紧凑系统,Labturbo 48紧凑型,Labturbo 24紧凑型系统,Labturbo 24 AIO SP-QPCR自动化系统,Vacezor
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