蛋白质凝胶电泳:定义和概述
蛋白质凝胶电泳的定义
凝胶电泳是实验室中最常用的标准技术之一，用于根据生物分子的大小或分子量来分离生物分子，如DNA、RNA和蛋白质。这是一种简单、灵敏、快速的分析工具。
蛋白质电泳是一种标准的实验室技术，在这种技术中，带电的蛋白质通过一个电场通过溶剂，通过一个凝胶基质运输。
电泳中使用的两种支撑基质是聚丙烯酰胺和琼脂糖。它们就像一个分子筛，根据分子质量将生物分子分离开来。
虽然琼脂糖有一个大的孔径，它是用来分离大的蛋白质复合物和核酸。而聚丙烯酰胺有小的孔径，它适合分离较小的蛋白质(5 - 250 KDa)5-500个碱基对的小核酸。
来追踪蛋白质的运动在凝胶基质中，电泳过程中，在样品缓冲液中使用跟踪染料。在实验室中使用的一种非常常见的染料是溴酚蓝，它在中性和碱性的ph值上着色。这种染料含有负电荷，由于它在电泳过程中随着蛋白质向阳极移动。
固定和分离的蛋白条带在凝胶基质上的可视化是通过凝胶染色完成的。一种在实验室中常用的蛋白质染色剂考马斯亮蓝R-250，也用于布拉德福德实验。这种染料与凝胶中的蛋白质紧密结合，使其呈现深蓝色，而丙烯酰胺则是无色的。
另一种更敏感的凝胶染色方法是银染色，它可以检测凝胶、核酸或多糖中甚至微量的蛋白质。
蛋白质凝胶电泳技术用于实验室分析蛋白质样本:
- 他们的纯洁
- 降解程度和异质性
- 亚基组成
在这篇文章中，我们将涵盖所有关于蛋白质凝胶电泳，包括它们的类型，工作机制，以及在实验室中的应用。
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聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种用于生命科学和生物技术实验室的技术，根据其电泳迁移率分离蛋白质和核酸。
聚丙烯酰胺是一种化学物质，用于制备电泳凝胶，在电泳过程中充当生物分子的筛子。它们是由丙烯酰胺和双丙烯酰胺混合制成的。凝胶的形成是这些分子通过添加聚合剂过硫酸铵(APS)交联和聚合的结果。
凝胶中产生的孔隙大小与聚丙烯酰胺浓度或百分比成反比。例如，聚丙烯酰胺浓度越高，孔径越小。高百分比的凝胶用于分解小蛋白质，而低百分比的凝胶用于大蛋白质。
实验室中使用多种形式的PAGE来提取感兴趣蛋白质的信息。其中，具有不连续缓冲体系的变性十二烷基硫酸钠PAGE (SDS-PAGE)被广泛用于实验室分离蛋白质。
sds - page
SDS- page凝胶置于含有十二烷基硫酸钠(SDS)的缓冲液中，SDS是一种使蛋白质变性为多肽的清洁剂。
当蛋白质样品在70-100℃之间加热时，在含有SDS和硫醇试剂的缓冲液中，会导致二硫键断裂，形成蛋白质亚基。由此产生的蛋白质亚基/肽与SDS结合，使它们带负电荷，并使它们向阳极移动。
图:SDS对蛋白质电荷和构象的影响。
在实验室中，SDS-PAGE是分析蛋白质最受欢迎的技术之一，因为它简单、快速，只需要微克的蛋白质样品。
类型的sds - page基于凝胶制备的有:
- 不连续凝胶:该技术涉及两种凝胶类型的制备，即溶解凝胶和堆积凝胶，这有助于获得蛋白质的最佳分辨率。
堆叠凝胶浇铸在溶解凝胶的顶部。它的pH值较低(如pH 6.8)，丙烯酰胺浓度较低(如孔径较大的丙烯酰胺浓度为7%)，离子含量也不同。
图:不连续凝胶排列的图解。
- 梯度凝胶:它不需要使用堆叠凝胶。凝胶中丙烯酰胺的浓度呈梯度增加，底部浓度较高，顶部浓度较低。
一个已知分子质量的参考蛋白，称为蛋白质阶梯，分子量标记，或蛋白质大小标准，与样品蛋白在同一凝胶中运行。它有助于测定样品蛋白质的质量。
图:SDS-PAGE的完整过程示意图。
Native-PAGE
它被称为非变性PAGE或原生PAGE。在这种方法中，蛋白质是根据它们的质量/电荷比分离的。该技术用于蛋白质样品的折叠态分析不使用变性物质．
- 蓝色的本地页面:在这里，考马斯亮蓝色染料被用来为原生蛋白复合物提供电荷，用于电泳迁移。然而，使用这种染料的局限性是，它可以作为一种洗涤剂，引起蛋白质复合物的变性，阻碍活性测定或western blot检测技术。
- 明确的本地页面:它利用蛋白质的内在电荷在电泳迁移过程中进行分离。用于分离酸性膜蛋白和水溶性蛋白。
- 量化本地页面:该方法利用蛋白质的等电点定量分离蛋白质。分离出来的蛋白质被洗出到溶剂中，转移到馏分收集器，这有助于识别每个金属辅因子，并通过使用高分辨率的ICP-MS对它们进行定量。主要用于分离天然或活性金属蛋白。
蛋白质凝胶电泳是如何工作的?
蛋白质凝胶电泳过程中涉及到洗涤剂SDS的使用。缓冲液中SDS(阴离子洗涤剂)的存在导致蛋白质变性为短肽链，并为它们提供负电荷。
因此，当电场被施加时，带负电荷的离子将开始从阴极(带负电荷)向阳极(带正电荷的电极)移动。与质量较大的蛋白质相比，较小的蛋白质或分子质量较小的蛋白质会移动得更快。
图:根据蛋白质的分子量将其从负电极分离到正电极的说明。
分离后，蛋白质将以固体条带的形式出现，使用凝胶染色可以看到。
分离的蛋白质用于几个实验目的，包括western blotting分析和质谱分析。因此，凝胶电泳是蛋白质组学研究的一个基本步骤。
凝胶缓冲体系选择
决定使用化学试剂进行电泳这取决于蛋白质的大小和数量以及实验的应用。
例如，Bis-Tris和tris -甘氨酸被用于分离广泛的蛋白质。然而，Bis-Tris在蛋白检测上的敏感性高于tris -甘氨酸。它适用于质谱、翻译后修饰分析或测序等应用。
一种广泛使用的缓冲系统是三甘氨酸或“Laemmli”系统。它的堆积凝胶的pH值为6.8，溶解范围为8.3-9.0 pH。然而，该系统的局限性是在蛋白质之间形成二硫键，以及还原剂(存在于负载缓冲液中)不能随蛋白质移动。通过使用较低pH值的缓冲液可以克服这些挑战，也可以为丙烯酰胺凝胶提供更大的稳定性。
预制凝胶vs.手工铸造凝胶
在大多数实验室中，研究人员通过遵循凝胶制备的标准配方铸造凝胶。这些凝胶被称为手工铸造凝胶。
然而,现在即食precast-protein凝胶可用于多种应用，从SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，到非变性蛋白分析。与手工铸造的凝胶相比，预制凝胶更方便，更一致。
此外，为了优化蛋白质的分辨率、保质期和凝胶的运行时间，它们采用不同的缓冲配方，包括醋酸三酯(Tris-acetate)、Tricine tris -甘氨酸(Tricine Tris-glycine)、Bis-Tris。使用这些预制凝胶还可以防止研究人员接触丙烯酰胺，丙烯酰胺是一种神经毒素和致癌物。
蛋白质凝胶电泳用于什么?
蛋白质凝胶电泳技术在不同的生命科学领域有着广泛的应用。其中包括:
- 蛋白质纯化或纯度测定
- 测定大小、酶活性和等电点(pI)
- 研究蛋白质的结构和功能
- 获取蛋白质表达调控的数据
在医学实验室中，蛋白质凝胶电泳被广泛用于分析血清蛋白，主要是白蛋白和球蛋白。该技术也有助于某些疾病的诊断，如多发性骨髓瘤和单克隆γ病。
此外，该技术适用于抗体分析、疫苗纯度和浓度的测定、血浆中激素和酶的检测以及抗生素的正确剂量的确定。
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蛋白质凝胶电泳是生命科学实验室中最常用的一种根据蛋白质分子量分离蛋白质的技术。程序根据蛋白质样本和实验目标分为不同的组。
例如，利用SDS-PAGE将蛋白质变性为多肽进行完整的分析，分离出来的蛋白质用于进一步的研究。而native- page则用于研究蛋白质，而不需要对其进行变性。
此外，还根据测定的目的配制缓冲系统，包括凝胶的运行缓冲液和加载缓冲液。
蛋白质凝胶电泳在医学、临床和工业领域有多种应用，如研究蛋白质功能、调节蛋白质表达、疾病诊断和确定抗生素剂量。
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