聚合酶链反应(PCR)基础知识
你知不知道穆利斯和迈克尔·史密斯获得了诺贝尔奖在1983年发现聚合酶链反应(PCR) ?
这一开创性的技术使科学家们能够在短短几个小时内将单链DNA复制上千亿次。这个实验所需要的只是试管，一些化学物质和加热。如果没有PCR，对生物体基因组进行分子和遗传分析将是不可能的。
这在体外工具是必不可少的在一系列的生物学实验室，包括分子生物学，植物生物学，动物学，和生物技术来放大一小段DNA。由此产生的PCR产品可用于其他实验室工作流程，如DNA指纹或基因分析。(您是否也知道大多数映射技术在人类基因组计划是否涉及PCR的使用?)
PCR通常被称为“分子表型”，今天，几种PCR方法可用于不同的目的，包括RT-PCR, Real-Time PCR，多重PCR和热启动PCR。
阶段的聚合酶链反应
不论不同类型的PCR，都是包括三个基本阶段：
- 变性阶段:这一阶段也称为核酸变性。在这里，在95°C加热DNA模板，通过破坏氢键，使其螺旋变成两条单链。
- 退火阶段:在50 - 65°C(称为退火温度)，引物结合到单链模板DNA。
- 伸长/扩展阶段:在这个阶段，新的DNA链开始合成。温度设定在72°C-74°C之间，此时Taq DNA聚合酶(主要用于PCR反应中的DNA聚合酶)与引物结合，并使用dNTPs(脱氧核苷酸三磷酸)形成新的DNA。
PCR所需试剂
试剂需要运行PCR分析包括DNA模板(可以是基因组DNA、质粒或cDNA)，DNA聚合酶酶、引物、dNTPs (dATP、dGTP、dCTP、dTTP)和PCR缓冲液，其中包括tris-HCL、KCL和MgCl2．
反应混合物中的所有这些成分以不同的方式影响聚合酶链反应，因为所有这些成分和谐地工作，为所关注的基因复制出数百万个扩增子。
在本文中，您将了解氯化镁的作用2在PCR反应中，它是如何促进这个过程的，以及它的浓度变化是如何干扰你的反应的。
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氯化镁的作用是什么2在PCR反应吗?
MgCl2(氯化镁)是一种必不可少的成分PCR反应混合液．作为一种辅助因子，它增强DNA聚合酶的酶活性，从而促进DNA扩增。
辅因子是非蛋白质离子或者帮助酶发挥作用的分子。因此，这些辅助因子的缺失将使酶死亡完全不执行任何函数．这些辅助因子既可以是带正电的金属离子(如锌、铁或镁离子)，也可以是碳基小分子(如维生素B12)。
看看这些更好理解的例子辅助因素的作用:
- 丙酮酸脱氢酶，参与糖酵解和柠檬酸循环，不能没有它的辅助因子，包括TPP, FAD, NAD+CoA和Mg2 +．
- 碳酸酐酶，一种在维持人体pH值方面发挥作用的酶，在没有它的辅助因子锌离子的情况下无法发挥作用。
除了增强DNA聚合酶活性，氯化镁2在PCR反应过程中，也有利于引物在特定位点的结合。
如何MgCl2工作吗?
MgCl2两者都有促进作用吗Taq DNA聚合酶模板DNA/RNA链的活性和引物退火特异性。
氯化镁的分子机理2增强Taq DNA聚合酶活性
Mg2 +PCR扩增过程中利用氯化镁的离子(或镁离子)促进Taq DNA聚合酶的催化活性。
但是它是如何做到的呢?
PCR扩增过程中，Mg2 +离子与dNTP的磷酸基结合，促进磷酸和磷酸的去除。生成的dNMP通过其磷酸基团与邻近核苷酸的3 ' OH(羟基)形成磷酸二酯键。
MgCl2的作用，促进引物结合
Mgcl2通过影响底漆熔化温度(Tm)，帮助底漆在特定的位置粘合。
Tm定义为DNA双链的一半被分解成单链时的温度，表明双链的稳定性。
的MgCl2增加PCR反应的Tm值，使引物与模板DNA的相互作用更好。氯化镁的镁离子2与DNA上带负电荷的磷酸盐离子结合，减少两条DNA链之间的静电斥力。这导致引物与其互补DNA链的适当退火。
镁过多或过少的影响
MgCl2对PCR方案的优化至关重要。需要最佳数量的试剂来创建适当的PCR条件，以适当地扩增所需的DNA/RNA模板片段。
PCR缓冲液中含有适量的氯化镁，支持正常的PCR反应。然而，什么是"适量的氯化镁指的是什么?
对于标准的PCR反应，1毫米到5毫米的氯化镁2使用。然而，2 mM的MgCl2是缓冲液制备中最常用的浓度。
即使知道了最佳用量，也需要对最终的氯化镁浓度进行优化2因为它会根据PCR的条件而有所不同。例如，对于GC含量高的DNA模板或使用不合适的引物时，MgCl的浓度高于2 mM2可能是必需的。
同时还需要增加氯化镁的用量2当试图补偿DNA提取物含有PCR抑制剂，因为他们也结合Mg2 +离子和降低其可用性。
此外，你必须注意MgCl过多或过少2也会对你的反应产生影响。
- 太多MgCl2：PCR反应中氯化镁含量过高，导致引物非特异性结合，导致DNA复制错误。因此，琼脂糖凝胶电泳显示更多的DNA条带。
在某些情况下，更高的MgCl2浓度也可能导致引物二聚体的形成。
- MgCl太少2：在这种情况下，引物将无法与DNA模板进行碱基对配对，从而导致扩增微弱或PCR完全失败。
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MgCl2是制备PCR缓冲液的重要原料之一。它参与提高Taq DNA聚合酶的催化活性，促进引物结合。
进一步研究了氯化镁的最佳浓度2对于正常的PCR来说是必要的，因为太多或太少都会降低PCR的产量。
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