什么是蛋白质纯化？定义，方法等
什么是蛋白质纯化？
在生物化学中，蛋白质是以多肽链形式排列的氨基酸的聚合物。蛋白质在细胞结构和功能中起着不可或缺的作用。
但是，为了研究蛋白质，首先识别和隔离它们很重要。为此，生物化学家执行通常被称为高通量蛋白纯化的方法。首先，分离单个蛋白质，然后根据分子量，溶解度，电荷和特定结合亲和力分离它们。这个过程可以帮助研究人员分析单个蛋白质并研究蛋白质的特征和相互作用。
蛋白质纯化可以定义为一系列步骤，以从复杂的混合物中获取和研究所需的蛋白质。隔离蛋白质将有助于分析蛋白质：
- 大小和结构
- 结合亲和力
- 生物活性
- 生理化学特性
- 蛋白质蛋白质相互作用
该过程具有许多实验应用，尤其是在重组蛋白的大规模生产中。（但是，天然蛋白质的纯化通常具有挑战性。在这种情况下，亲和力标签像多组氨酸一样，谷胱甘肽-S-转移酶和HIS标签也被用来隔离和固定它们。）
在本文中，我们概述了所涉及的纯化步骤，方法和策略。
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蛋白质纯化如何工作？
为了成功分离蛋白质，它必须经历蛋白质纯化的过程。该过程的一般步骤如下：
1.细胞裂解
细胞裂解是使用各种酶促方法（蛋白酶抑制剂），化学方法（洗涤剂）或物理方法（Sonication）的细胞破坏和蛋白质的破坏。结果，细胞裂解物将含有可溶性和不溶性蛋白，核酸，细胞碎屑，细胞器和膜残留。
2.澄清
但是，目标是仅获得要纯化的蛋白质。为此，细胞进行下一步澄清以去除所有污染物。这是通过过滤或离心。
一旦实现，蛋白质提取物就可以浓缩了。
3.蛋白质结合
下一步是将蛋白质与提取物分离。这有时也称为恢复阶段。在这里，通过将蛋白质分子与基质结合来分离蛋白。这是通过类似的技术进行的亲和色谱和磁珠分离。
4.洗脱
洗脱是通过用溶剂洗涤提取一种吸附到另一种材料的过程。适当的洗脱缓冲液用于洗涤色谱柱上的所有非特异性结合。洗涤的数量和长度将取决于所使用的列的类型。
通过更改色谱柱的pH，进行所需蛋白质的洗脱；带电的蛋白质功能组中和，因此可以提取。该过程涉及使用洗脱缓冲液和像咪唑（用于HIS标记蛋白）的试剂，这些试剂在高浓度中有效地洗脱了靶蛋白。该过程有助于研究人员获得高蛋白质浓度以进行进一步分析。
4蛋白纯化方法和策略
进行蛋白质纯化的主要不同方法。让我们在下面更详细地查看每个：
色谱法
色谱法是用于获得靶蛋白样品的常见技术。它根据其性质的差异将物质分离。这是一种众所周知的纯化技术，涉及使用填充树脂的柱子，从中可以提取感兴趣的蛋白质。
色谱技术在固定相和流动相的原理上起作用，其中固定相是色谱柱中的树脂，流动相是液体溶剂。感兴趣的蛋白质（或在某些情况下杂质）在固定相中与配体结合，而每个流动相可以去除杂质或洗脱蛋白质。
一种常见的色谱技术是高性能液相色谱法（HPLC）。可以根据要纯化的蛋白质采用其他类型的色谱技术，例如：
- 亲和色谱
- 尺寸排斥色谱
- 离子交换色谱
- 阳离子交换色谱
- 凝胶过滤色谱法
- 疏水性色谱
隔离
分离是所有蛋白质纯化策略中最简单的，因为在这种情况下，纯蛋白通常是通过以下方式获得的。
- 超中心：可以根据浓度梯度的差异分离蛋白质。离心机帮助将较大蛋白质与较小蛋白分开。这种类型的离心物的颗粒和上清液可用于进一步纯化。
- 分馏：这是基于蛋白质溶解度的差异。蛋白质不会在高盐浓度的溶液中溶解，因此可以通过极高的盐引入盐来隔离。
沉淀
另一种纯化方法是盐沉淀。盐沉淀并不那么流行或普遍使用，因为它并不总是产生高度纯化的蛋白质。
这种纯化过程有效地“盐出口”或从混合物中挖出蛋白质。通过使用硫酸铵作为盐引入高渗透压来实现降水。
不同蛋白质以不同浓度的硫酸铵沉淀。一旦蛋白质沉淀，通过过滤或凝胶排除色谱法。
免疫印迹
免疫印迹是一种可视化蛋白质的高度使用的技术，有时与亲和色谱结合进行。这是一种主要用于检测蛋白质的快速和敏感测定。
蛋白质的免疫印迹也称为蛋白质印迹。在典型的蛋白质印迹中，抗体用于检测所需的蛋白质。
首先使用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠凝胶电泳）将蛋白质分开。然后将它们转移到多孔膜上并阻塞以防止任何非特异性抗体结合。
阻塞后，将膜与特异性蛋白质特异性抗体一起孵育。然后，将其与特定于初级抗体的二抗孵育。二抗通常与产生检测信号的酶结合。因此，只有感兴趣的蛋白质会发出信号。这种蛋白质提取方法还有助于表明蛋白质表达。
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