CRISPR-Cas9是什么?定义和概述

CRISPR-Cas9是什么?

要了解CRISPR-Cas9，我们必须首先熟悉基因编辑。基因编辑是改变生物体遗传密码或基因组的过程。这项研究也被称为基因组编辑，在产生和发展辅助技术以寻找危及生命的人类疾病的答案方面有着丰富的历史。

几种可编程的序列特异性内切酶已被用于编辑DNA和询问导致人类变异或疾病的遗传元素，包括Cas9，转录激活子样效应子核酸酶,锌指核酸酶．

其中最新和最引人注目的基因组编辑工具是CRISPR-Cas9。CRISPR代表“有规律地聚集在一起的间隔短回文重复”，是DNA序列的一小段。Cas9是crispr相关蛋白9。

独特的CRISPR-Cas系统在科学界引起了轰动，因为它能够切割特定的DNA片段，以所需的方式改变它，并修改基因功能。

CRISPR-Cas工具是由Jennifer A. Doudna, Emmanuelle Charpentier和Martin Jinek在2012年．他们利用CRISPR-Cas903manbetx.com 并发现它可以在任何想要的地方切割任何基因组。Charpentier和Doudna后来获得了奖金2020年诺贝尔化学奖感谢他们的开创性工作。

在这篇文章中，我们将介绍CRISPR-Cas9系统，它的机制，应用和局限性。

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CRISPR如何工作?

的CRISPR-Cas9系统是从细菌和古菌的免疫系统中进化而来的。他们使用六种不同类型的CRISPR-Cas系统来保护自己免受入侵的病毒或任何外来病原体的伤害。这是由Rodolphe Barrangou和一组研究人员乳酸链球菌细菌。

以下是它们防御机制的高级序列:

1. 噬菌体侵入细菌细胞。
2. Cas1和Cas2蛋白质获取噬菌体的一段DNA，并将其整合到CRISPR阵列中。
3. 然后DNA被转录成pre-crRNA。
4. pre-crRNA被I型、II型、III型、IV型、V型或VI型系统进一步处理并分类为crRNA，进一步参与靶标定位和降解。

图片:一个工作机制的说明在对抗噬菌体的细菌中的CRISPR-Cas系统。

CRISPR-Cas9

在大多数实验室在美国，CRISPR-CAS9系统(II型系统)被发现是最适合实验研究的。

CRISPR-Cas9由两个促进基因组编辑的关键分子组成:

• Cas9酶:Cas9酶就像剪刀一样在特定的位置切割基因组DNA，从而促进DNA碱基对的添加或删除。
• RNA分子:通常称为引导RNA (gRNA)，它是位于较长的RNA支架中的一小段预先设计的RNA序列(约20个核苷酸碱基长)。它由CRISPR RNA或(crRNA)和tracrRNA组成。它引导Cas9酶到达需要切割的特定目标位置。

CRISPR-Cas9系统在实验室中的工作机制与细菌的工作机制相似。它的应用实验室的实验包括以下步骤:

• 选择一种生物进行实验:选择你想要为实验编辑其基因组的生物体。需要注意的是，CRISPR还没有被完全批准用于人类基因组的实践。它只允许在动物模型和分离的人体细胞上进行。

如果你正在研究基因疾病的治疗，选择基因组最接近人类的动物模型。

• 选择靶基因位置:选择要编辑或更改的目标基因位置。收集更多关于目标DNA序列的信息，如其基因表达、GC含量、表型、表型变异、snp和任何其他突变。这将指导你设计sgRNA和定位PAM(原间隔相邻基序)序列。
• 选择CRISPR-Cas9系统:根据您的实验选择合适的Cas9核酸酶和CRISPR序列。
• 选择和设计sgRNA:使用在上一步中提取的序列信息计算设计sgRNA。
• 合成并克隆sgRNA:选择一个特定的质粒，将sgRNA插入其中，并克隆成多个副本。然后，从质粒中分离合成的sgRNA拷贝。
• 交付sgRNA和Cas9:使用基因转移技术如电穿孔法将Cas9和sgRNA插入靶细胞。
• 验证实验:要了解操作是否完成或酶是否在目标序列上被切断，请执行实验如聚合酶链反应，体外转录，或新一代测序．
• 培养改变的细胞:用合适的培养基培养改良的细胞株。当获得足够的细胞系时，将它们插入所选的模型生物中。

在细胞中，由CRISPR-Cas系统形成的缺口将通过非同源端连接(NHEJ)或同源定向DNA修复(HDR)来填补。

图片:一个示意图DNA修复图在裂解位点通过NHEJ或HDR(使用供体模板)。

• 基因表达研究:检查在活的有机体内插入DNA的基因表达RT-PCR或定量PCR．
• 分析结果:利用计算技术对结果进行分析，以确定是否成功，并研究生物体的表型变化。

常见CRISPR应用程序

CRISPR-Cas9有几个潜力临床应用：

• 基因疗法和治疗疾病，如艾滋病毒，癌症，乙型肝炎，高胆固醇血症和其他疾病。
• 修饰干细胞，然后可能被重新注射到患者体内，以修复受损的器官。
• 在食品和农业行业中设计益生菌培养和保护工业培养(如酸奶)免受病毒的侵害。
• 改良作物以提高其产量、耐旱性和营养特性。

它在编辑体细胞基因组方面还有其他几个应用。然而，由于其伦理影响，编辑生殖细胞或人类胚胎的可能性仍然是科学家们争论的话题。

CRISPR局限性

CRISPR是最具活力的基因编辑工具之一。尽管CRISPR-Cas9系统比其他基因组工程技术更有效，但它也并非没有缺点。它的一些局限性是:

• 它有一种“脱靶效应”的现象，即DNA在预期靶点以外的位置被切割，导致不必要的突变。
• 有时，即使系统在切割目标时，它也可能不会在精确的位置切割。
• 将CRISPR-Cas9系统移植到成熟细胞群中是很困难的。
• 这不是100%的效率;即使当细胞使用CRISPR-Cas9系统时，它也并不总是显示出任何基因编辑活动。

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CRISPR-Cas9是一种革命性的基因工程工具，由原核生物改编而来，用于精确和特异性地改变DNA，以用于治疗。它通过切割特定位置的双链DNA来添加或删除所需的序列，从而帮助操纵生物体的基因组。

今天，CRISPR-Cas9被用于03manbetx.com 医药领域、治疗目的以及食品和农业。

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