gRNA:定义和应用

什么是引导RNA (gRNA)?

基因编辑，也被称为基因组工程，是一项革命性的技术，通过修改DNA来治疗疾病和改善人类健康。

在这些技术中有CRISPR-Cas系统，代表有规则间隔的聚类短回文重复。它是由两部分组成：

指导RNA (gRNA):识别目标DNA中感兴趣区域的特定RNA序列。它与Cas9蛋白结合，并将其引导到目标位点进行修饰过程。

CRISPR gRNA本身由两个单元组成:

CRISPR RNA (crRNA):由17-20个核苷酸序列组成，与目标DNA序列互补，由于重复序列也具有间隔区。
tracrRNA:作为Cas核酸酶的结合支架。
CRISPR-associated (Cas)核酸酶:一种非特异性内切酶，由CRISPR定向于目标序列引导RNA使双链断裂。

尽管Cas核酸酶已经从不同的细菌中分离出来，但最常用的SpCas9是从不同的细菌中分离出来的酿脓链球菌．

导向RNA还有另一种变体，由单个RNA分子组成，被称为单导向RNA (sgRNA)。它有一个定制设计的短crRNA序列与支架tracrRNA序列连接，以促进裂解过程。

图:sgRNA和Cas9复合物的形成示意图。

本文就gRNA在CRISPR-Cas9系统中的工作机制、实验室gRNA设计用于实验室检测、利用gRNA改变生物基因组序列进行研究等方面进行综述。

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gRNA是如何工作的?

gRNA有多种作用用CRISPR-CAS9系统。该系统的两个部分，crRNA和tracrRNA协同工作，完成基因组编辑过程。gRNA的tracrRNA识别cas9蛋白并与之结合。然后，cas9蛋白从crRNA获得序列信息，并走向目标位点。

在确定目标位点后，crRNA与序列结合并稳定DNA-RNA复合体。cas9蛋白识别PAM(原间隔相邻基序，长度通常为2-6个碱基对)序列，5 ' -NGG-3 '区域，并在crRNA结合位点上游开始切割过程。

图:gRNA在CRISPR-Cas9系统中作用的说明。

gRNA在原生生物

在原生生物的线粒体中，利什曼虫tarentolae，转录后RNA编辑过程发生。

原生生物有小圆和大圆DNA。当大多数maxicircle(编码区有16-17千碱基对，也编码一些gRNA)的转录本或mRNA由于移码突变而不能进行蛋白质合成时，引导RNA通过在特定位置删除和插入尿苷残基，在转录后纠正突变。

设计gRNA

科学家们修改野生型gRNA序列在实验室里测试它在编辑核酸和开发许多致命疾病的治疗方法方面的功效。

目前，CRISPR库设计工具可以帮助研究人员轻松地设计和优化多个gRNA序列，提高编辑效率，验证，减少脱靶效应。

gRNA是可以设计的在体外或在活的有机体内使用模板DNA和定制设计的crRNA与支架tracrRNA序列融合。

CRISPR-Cas9系统的靶向特异性主要取决于gRNA 5 '端存在的20个核苷酸序列。靶序列通常在原间隔相邻基序(PAM)之前，在靶解理区之后。

当gRNA形成时(通过连接crRNA和tracrRNA)，它与目标位点结合，并与Cas9蛋白组装一个核糖核蛋白(RNP)复合体，在PAM上游约3个核苷酸的位点启动双链断裂。

在设计gRNA之前，应确保gRNA的GC含量在40-80%之间，并且gRNA序列的长度应在17-24个碱基对左右，以减少脱靶效应。

预测gRNA功效

没有通用的技术可以为你的实验选择正确的gRNA。然而,影响其功效的因素和准确性包括:

用于产生可转染的引导RNA的方法，如在体外转录，合成方法，或慢病毒传递技术。
靶核酸的动态方面，如染色质排列或状态对靶位点的可及性。

在使用转录调节和敲除方法时，建议检查一个基因的gRNA设计谱，而不是只根据一个测试得出结论。

gRNA的作用是什么?

重组gRNA与其他试剂一起用于实验室进行一系列实验室分析，包括经典的PCR、多重PCR、全基因组测序、克隆、细胞系开发、引物和重组质粒DNA，以及DNA修饰、突变和基因表达研究的错配分析。

下面是一些涉及gRNA使用的应用程序。

基因组编辑

CRISPR-Cas系统是一种高效、简单、多功能的实验室基因改造工具。

Cas9蛋白与目标序列结合后，在PAM序列上游产生双链断裂。的破损可以用两种方法修复：

非同源端连接(NHEJ):当没有供体DNA时使用的一种容易出错的方法。它有助于产生一个indel，导致蛋白质功能的有效敲除。
Homology-directed修复(HDR):当供体DNA序列可用时，该方法将发挥作用。它在创造目标基因的精确敲入中起着作用。

使用CRISPR-Cas进行基因组编辑是有效和简单的，因为它更容易被实验室所接受即使是那些没有分子生物学专业知识的人-用于基因组工程、分子和功能分析。

基因激活和沉默

CRISPR-Cas9系统是研究人员用于基因激活、基因表达和基因抑制研究的最主要技术之一。通过修饰Cas9蛋白，可用于机械调控靶基因活性。

研究人员已经创建一种改良的dCas9蛋白，缺乏裂解活性，但具有DNA结合亲和力。它可以很容易地与转录激活因子(CRISPRa)和抑制因子(CRISPRi)融合，从而控制基因的表达。

此外，它还可以与荧光标记融合，如绿色荧光蛋白(GFP)，以检测感兴趣的特定基因的位置。

图:CRISPR-Cas敲除和敲入机理示意图。

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gRNA是CRISPR-Cas系统的重要组成部分，它与Cas9蛋白形成复合物，在核酸中产生断裂。

它由两种成分组成，crRNA和tracrRNA，这两种成分都有助于实现gRNA的功能。实验室里的科学家修改野生型crRNA的序列，并将其作为研究研究的工具，包括基因修饰、基因激活和沉默以及基因组工程。

除了是一种简单和多功能的技术，CRISPR-Cas也是一种昂贵的技术。因此，如果您正在进行高通量的实验，我们建议您继续高科技实验室设备．获得合适的设备可以帮助您节省时间，因为它消除了重复实验的要求和潜在的试剂浪费。

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