逆转录PCR (RT-PCR)的基础
什么是逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)?
逆转录聚合酶链反应是一种俗称RT-PCR的分子技术。聚合酶链反应代表聚合酶链反应，一种实验室方法，用于扩增DNA的特定区域，用于诊断和医学研究分析．逆转录酶PCR以mRNA作为起始模板，而不是DNA。
Real-time RT-PCR是一种改良的PCR，其中的酶被称为逆转录酶使用。这种酶有助于将RNA序列转化为其互补的DNA序列。RT-PCR的工作原理就是逆转录。它是一种将RNA的逆转录转化为DNA和目标DNA扩增相结合的实时技术。它是一种定性检测特定RNA序列的方法，具有很高的准确性和敏感性。
卡里·穆里斯(Karry Mullis)发现RT-PCR有助于RNA检测和定量。他赢得了1993年诺贝尔化学奖他引进了这项技术，彻底改变了分子生物学领域。
rt - pcr应用程序
RT-PCR应用于:
- 基因组测序
- 检测基因或染色体的变化
- 特征的基因
- 基因表达和突变的研究
- RNA病毒的研究
- 白血病等疾病的诊断
- 感染监测。
RT-PCR的巨大贡献可见于诊断rna病毒SARS-CoV-2．它成为了检测特定RNA序列的基准技术，正是因为它的敏感性在体外这种方法使冠状病毒的大规模诊断成为可能。
在这篇文章中，我们将回顾实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的过程，以及它与其他类型的PCR技术的区别。
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rt - pcr过程
RT-PCR是一种分子诊断工具，其工作原理是利用逆转录酶将RNA模板转化为互补DNA (cDNA)。然后，该cDNA通过PCR进行指数扩增，形成多个拷贝，然后用于下游分析。
在典型的PCR中，DNA是模板，所用的酶是模板聚合酶．然而，由于RNA不是Taq聚合酶的有效模板，为了扩增RNA，需要进行逆转录。因此，修改后的PCR多了一个步骤，即将RNA转化为DNA，然后进行PCR。
首先，典型的RT-PCR检测需要核酸、引物、逆转录酶、RNA样本、DNA聚合酶，以及RT-PCR缓冲液。
让我们来详细了解一下RT-PCR的过程:
- 进行RNA分离后，提取RNA。
- 将提取的RNA样本的混合物加入到反应混合物中。反应混合物由核苷酸、逆转录酶和针对感兴趣基因的特异性引物组成。
- 如果目标存在，引物将退火到提取的RNA。
- 逆转录酶完成其合成互补DNA (cDNA)链的功能。
- RNA/DNA杂交现在经历了PCR的步骤:
- 变性:在95年oC RNA/DNA链变性。
- 退火:引物退火到新形成的cDNA
- 扩展:聚合酶从引物延伸，通过复制合成一条新的DNA链。
- 热循环器的多次循环增加了作为PCR产物的DNA拷贝数。
此外，RT-PCR可以通过两种不同的方式进行:
互译rt - pcr
在这种方法中，逆转录反应和聚合酶链反应的反应管是相同的，两个过程是同时进行的。这种简单方便的一步法用于进行少量的测定。由于两种反应都是在一个反应管中进行的，因此所用的引物具有序列特异性。
优点:
- 快速设置
- 处理时间短
- 污染的可能性极小
- 简单的处理
缺点:
- 单独优化两种反应是有限度的
- 不敏感
- 为了分析新的靶标或重复扩增，需要保存RNA分流
两步rt - pcr
在这个PCR反应中，RNA到cDNA的逆转录最初在40岁之间进行oC和50oC.分离得到的cDNA进行扩增——cDNA合成和PCR扩增是不耦合的。
每一步所用的反应容器、缓冲液、试剂、条件和引物策略都是不同的。与一步RT-PCR不同，两步RT-PCR使用随机六聚体、基因特异性引物和寡聚dt引物的混合。这使得获得的cDNA产量更高，可以储存或进一步扩增。
这是一种高度敏感但耗时的方法。
优点:
- RT引物可选
- 从一个单一的RNA源，可以扩增多个目标
- 即使起始材料有限，也能完成吗
- 反应优化是灵活的
- 逆转录酶和DNA聚合酶可以单独选择，灵活性更大
缺点:
- 更多的机器时间和设置
- 更优化的需要
- 增加受污染的机会
RT-PCR、qPCR和RT-qPCR有什么区别?
rt - pcr
RT-PCR是指逆转录PCR，而不是real-time PCR。这是一种允许从RNA模板生成cDNA的方法。然后将单链cDNA转化为双链cDNA进行扩增。
RT-PCR主要用于感兴趣基因(GOI)的分子克隆。
qPCR
qPCR代表定量实时聚合酶链反应．它是一种采用典型PCR原理的定量分析方法。然而，在这个过程中，DNA扩增的测量是实时进行的，而不是在过程的最后使用琼脂糖凝胶。
PCR产物的定量使用插入染料或水解荧光探针等荧光探针进行。定量PCR有助于病原体的检测和确定感兴趣的DNA序列的拷贝数。
样品制备:分离出不受任何污染的DNA。
RT-qPCR
RT-PCR与qPCR相结合，产生了RT-qPCR方法。在这里，RT-PCR是第一步，其次是qPCR。在qPCR反应中可以使用cDNA来测量RNA水平。此外，含有抑制剂、兴奋剂、siRNA或敲除模型的模型系统被用于研究基因表达的变化。
样品制备:起始模板为RNA，可以进行RNA提取。提取RNA的类型取决于所需RNA的类型。总RNA提取试剂盒分离出mRNA、tRNA、rRNA、ncRNA和miRNA。值得注意的是，RNA应该不受任何DNA污染。
使用虚拟凝胶电泳系统降解样品是一种首选的方法。
qPCR和RT-PCR主要采用两种检测方法:
- 荧光染料:这些非特异性结合双链DNA。一种流行的荧光染料是SYBR®Green，插入新合成的DNA。更多的荧光意味着产生更多的DNA。
- 水解探针:像TaqMan这样的探测器依赖于Förster共振能量转移(FRET)。这些特异序列下游结合qPCR引物，使其具有靶标特异性。
qPCR和RT-qPCR周期的定量和数据分析采用起始期、指数期和平台期扩增曲线进行。
这条扩增曲线是用一系列已知浓度的标准品稀释后得到的。数据的分析可以基于绝对定量或相对定量。
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RT-PCR已成为一种日益重要的分子生物学技术，在全球广泛应用，特别是在疫情爆发后COVID-19病毒．这种方法给医学研究带来了新的希望，可以进行疾病诊断、分子克隆和重组DNA技术。
RT-PCR需要一个适当的设置和无污染的环境进行传导。虽然使用的材料可能相似，但RT-PCR、qPCR和RT-qPCR是完全不同的PCR方法。
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