逆转录PCR（RT-PCR）的基础知识
什么是逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）？
逆转录聚合酶链反应是一种通常称为RT-PCR的分子技术。pcr代表聚合酶链反应，这是一种实验室方法，用于扩大DNA的特定区域进行诊断和医学研究分析。逆转录酶PCR而不是DNA使用mRNA作为起始模板。
实时RT-PCR是PCR的修改版本，该酶称为PCR逆转录酶用来。该酶有助于将RNA序列转化为其互补DNA序列。RT-PCR遵循这一逆转录原理。这是一种实时技术，将RNA逆转录到DNA和靶DNA的扩增。这是一种定性方法，可以检测具有高度准确性和灵敏度的特定RNA序列。
卡里·穆利斯（Karry Mullis）发现了RT-PCR，以促进RNA检测和定量。他赢了诺贝尔化学奖1993用于引入这种技术并彻底改变了分子生物学领域。
RT-PCR应用
RT-PCR持有：
- 基因组测序
- 检测基因或染色体的变化
- 基因的表征
- 基因表达和突变的研究
- RNA病毒研究
- 诊断白血病等疾病
- 感染的监测。
在诊断中可以看到RT-PCR的巨大贡献RNA-VIRUS SARS-COV-2。它成为检测特定RNA序列的基准技术，这是因为这种敏感的体外冠状病毒大规模诊断的方法已成为可能性。
在本文中，我们将回顾实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）过程，以及它与其他类型的PCR技术的变化。
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RT-PCR过程
RT-PCR是一种分子诊断工具，可用于使用逆转录酶将RNA模板转换为互补DNA（cDNA）的原理。然后，该cDNA使用PCR进行指数扩增以形成多个拷贝，然后将其用于下游分析。
在典型的PCR中，DNA是模板，所使用的酶为TAQ聚合酶。但是，为了扩增RNA，需要进行逆转录，因为RNA不是TAQ聚合酶的有效模板。因此，修改后的PCR具有额外的RNA转换为DNA，然后进行PCR。
首先，典型的RT-PCR分析需要核酸，引物，逆转录酶，RNA样品，RNA样品，DNA聚合酶和RT-PCR缓冲液。
让我们详细了解RT-PCR过程：
- 进行RNA分离后，提取RNA。
- 将提取的RNA样品的等分试样添加到反应混合物中。反应混合物由核苷酸，逆转录酶和针对感兴趣基因的引物组成。
- 如果存在靶标，将底漆向提取的RNA退火。
- 逆转录酶执行其合成互补DNA（cDNA）链的功能。
- RNA/DNA混合动力现在经历了PCR的步骤：
- 变性：95oc RNA/DNA链变性。
- 退火：向新形成的cDNA退火
- 扩大：从底漆延伸，聚合酶通过复制合成新的DNA链。
- 热循环中的多个循环增加了DNA作为PCR产物的拷贝数。
此外，RT-PCR可以通过两种不同的方式进行：
1步RT-PCR
在这种方法中，逆转录和聚合酶链反应的反应管是相同的，并且同时进行两个过程。这种简单便捷的一步方法用于执行少量测定。由于两种反应都是在单个反应管中进行的，因此所使用的引物是序列特异性的。
优点：
- 快速设置
- 较短的处理时间
- 污染的机会最小
- 易于处理
缺点：
- 单独优化两个反应是有限制的
- 不太敏感
- 要分析新目标或重复放大，需要保存RNA等分试样
2步RT-PCR
在这种PCR反应中，RNA向cDNA的逆转录在40之间进行oC和50oC.然后在分离的反应中扩增所得的cDNA - CDNA合成和PCR扩增被取消耦合。
每个步骤中使用的反应容器，缓冲液，试剂，条件和启动策略是不同的。与单步RT-PCR不同，随机六聚体，基因特异性引物和寡-DT引物的混合物用于两步RT-PCR。这允许获得更高的cDNA产量，可以存储或进一步扩增。
这是一种高度敏感但耗时的方法。
优点：
- RT引物可以选择
- 从单个RNA来源，可以扩增多个目标
- 即使起始材料有限，也可以执行
- 反应优化是灵活的
- 可以单独选择逆转录酶和DNA聚合酶，具有更大的柔韧性
缺点：
- 更多机器时间和设置
- 需要更多优化
- 污染的机会增加
RT-PCR，QPCR，RT-QPCR有什么区别？
RT-PCR
RT-PCR代表逆转录PCR，而不是实时PCR。这是一种允许从RNA模板生成cDNA的方法。然后将单链cDNA转换为双链cDNA并扩增。
RT-PCR主要用于感兴趣基因（GOI）的分子克隆。
qpcr
QPCR代表定量实时PCR。这是使用典型PCR原理的定量分析方法。然而，在此过程中，DNA扩增的测量是实时的，而不是在过程结束时用琼脂糖凝胶进行测量。
PCR产物的定量是使用荧光探针（如插入染料或基于水解的荧光探针）进行的。定量PCR有助于检测病原体和目标DNA序列的拷贝数的测定。
样品制备：无污染的DNA分离出来。
RT-QPCR
RT-PCR与QPCR相结合产生了RT-QPCR的方法。在这里，RT-PCR是第一步，其次是QPCR。可以在qPCR反应中使用cDNA来实现RNA水平的测量。此外，使用抑制剂，兴奋剂，siRNA或敲击模型的模型系统用于研究基因表达变化。
样品制备：起始模板是RNA，可以实现RNA提取。RNA提取的类型取决于所需的RNA类型。总RNA提取试剂盒分离mRNA，tRNA，rRNA，ncRNA和miRNA。重要的是要注意，RNA应免于任何DNA污染。
使用虚拟凝胶电泳系统进行样品降解是一种首选方法。
主要是，qPCR和RT-PCR中使用了两种类型的检测方法：
- 荧光染料：这些与双链DNA非特异性结合。流行的荧光染料是SYBR®绿色，它与新合成的DNA插入。更多的荧光意味着产生更多的DNA。
- 水解探针：像Taqman这样的探针取决于Förster共振能量传递（FRET）。这些是将下游与QPCR引物结合的特定序列，使其成为特定于靶标。
QPCR和RT-QPCR循环结果的定量和数据分析是在启动，指数和平稳期的放大曲线的帮助下进行的。
这种放大曲线是使用已知浓度标准的连续稀释产生的。数据的分析可以基于绝对定量或相对定量。
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RT-PCR已成为越来越重要的分子生物学技术，在全球范围内广泛使用，尤其是在爆发之后2019冠状病毒。该方法为医学研究提供了新的希望，以进行疾病诊断，分子克隆和重组DNA技术。
RT-PCR需要适当的设置和无污染的环境进行传导。尽管使用的材料可能相似，但RT-PCR，QPCR和RT-QPCR完全是不同的PCR方法。
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