T4多核苷酸激酶:定义与概述

T4多核苷酸激酶的定义

核酸可以被修饰在多核苷酸水平通过许多酶的反应。它包括DNA和RNA的甲基化，DNA的糖基化，以及DNA和RNA分子3 ' -羟基端核苷酸的添加。

多核苷酸激酶(PNK)是一种将磷酸基添加到核酸分子上的DNA修饰酶。它们从三磷酸腺苷(ATP)转移到DNA或RNA的5 '羟基端。此外，它们还在某些情况下进行磷酸酶活性。

的酶是最早被发现的理查德森和赫维茨实验室用感染了T4和T2噬菌体的大肠杆菌(或E. coli)进行了实验。它属于转移酶家族特别是那些将含磷基团转移到醇基的酶(磷酸转移酶)。系统地说，这种酶类被称为ATP:5 ' -二磷酸多核苷酸5 ' -磷酸转移酶。

T4 PNK分子量为132 kDa。它是由相同的单体组成的四聚体每个单体的分子量都是33kda没有动力学合作性。

这种酶所起的双重作用——激酶和磷酸酶——位于其各自的结构域内。n端是一个具有核苷酸结合基序GXXXXGK(S/T)的5 '激酶结构域，c端是一个3 ' -磷酸水解酶结构域。

PNK是实验室中研究基因表达、DNA修饰或生物克隆的必备工具。虽然多核苷酸激酶家族包括来自各种生物的PNKs，但通常情况下，实验室中使用的酶是从感染了T4噬菌体的大肠杆菌B(抑制剂-减)细胞中纯化的。

T4多核苷酸激酶(PNK)的抑制剂是铵离子、KCL或NaCl和低水平的磷酸盐缓冲液。此外，加入EDTA或在70°C加热酶15分钟会导致T4 PNK活性失活。

在这篇文章中，我们将介绍T4多核苷酸激酶的功能和机制，它们的应用，以及为检查制造的T4多核苷酸激酶产品的功效而进行的质量控制测试。

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T4多核苷酸激酶的功能

多核苷酸激酶(PNK)具有激酶和磷酸酶的双重活性。这些功能取决于生物的反应条件。

下面是一个PNK执行的角色列表在不同的生物:

该酶参与核酸末端的磷酸化。这种情况下的PNK反应表示为:

ATP + 5 ' -去磷dna⇌ADP + 5 ' -去磷dna

T4 PNK参与修复损坏的RNA和DNA末端。它通过将3 ' PO4/5 ' OH末端转化为3 ' OH/5 ' PO4末端，使其适合于DNA和RNA连接酶的连接。

例如，在后生动物和裂变酵母中，由于氧化、辐射和拓扑异构酶I中毒而损坏的DNA通过PNK同源物的5’OH磷酸化的特定活性进行修复。

PNK磷酸酶在氧化应激或拓扑异构酶I中毒导致的DNA损伤修复过程中对DNA末端处理至关重要。酶可以同时处理3 ' -磷酸和5 ' -羟基末端。
在T4感染期间，细菌试图通过诱导宿主细胞trna的位点特异性断裂来保护自己。然而，T4 PNK在噬菌体中修复破损的trna，促进T4感染。酶促反应包括两个步骤:

γ磷酸从ATP转移到RNA的5 ' OH端。
RNA的3 ' PO4端水解。
PNK磷酸酶的任何突变，导致早发性顽固性癫痫、常染色体隐性小头畸形和发育迟缓

哪些领域使用T4 PNK?

T4 PNK引起核酸末端的磷酸化，这个反应的最终产物被用于许多实验目的。

这两个最重要的领域应用T4 PNK包括:

分子生物学:T4 PNK在标记和连接实验中被广泛用于磷酸化DNA和RNA的5 '端。此外，它还用于克隆目的。
生物化学:除了在核酸上添加磷酸基外，还可用于去除核苷酸/核苷或DNA和RNA上的3 '磷酸基，以研究基因表达和基因功能。此外，它还被用来理解不同生物体内不同的核酸反应。

T4 PNK应用程序

T4 PNK在核酸5 '端用32P标记的应用为分子克隆、结构分析、核酸测序等方面的进展奠定了基础。

该酶在实验室中与其他试剂一起使用基于实验，包括DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，1X T4多核苷酸激酶反应缓冲液，和存储缓冲区它是通过添加:

10毫米Tris-HCl
50 mM氯化钾
1毫米德勤
0.1毫米EDTA
50%甘油
0.1µM ATP
pH 7.4 @ 25°C

这种酶在商业上以单位出售，对它的了解有助于确定实验所需的酶的数量。

单位定义:一个单位的T4多核苷酸激酶酶被定义为在37°C下30分钟内催化1纳摩尔磷酸从[γ-32P]ATP转移到多核苷酸的5´-OH端所需的T4 PNK量。

下面是所涉及的实验室分析列表使用T4 PNK：

用于标记DNA和RNA的5 '端，用作:

杂交探针
记录映射探针
凝胶电泳标记
DNA测序引物
PCR引物

寡核苷酸的合成
RNA扩增和标记
5 ' -磷酸化寡核苷酸，PCR产物和其他DNA或RNA在连接前
PCR引物的磷酸化
用[32P]后标记法检测DNA修饰
3 ' -磷酸基的去除
3 '磷酸化寡核苷酸的5 '末端标记

核酸的标记

T4 PNK最常用于实验室的标签目的。它广泛用于DNA、RNA、短寡核苷酸探针和其他分子的末端标记。

可逆的PNK反应也是可能的，因为这将使核苷酸在不使用碱性磷酸酶的情况下被去磷酸化。

磷酸化

在连接和克隆实验之前，T4 PNK会导致多种分子的磷酸化，包括寡核苷酸、单链和双链dna和rna以及核苷3 ' -单磷酸。

在交换反应混合物中加入聚乙二醇(PEG)和亚精胺可以改善和提高磷酸化反应的效率。

多核苷酸激酶也用于催化脱氧核苷3´-单磷酸、3´-磷酸化多核苷酸和脱氧核苷3´-二磷酸的去磷酸化。

质量控制测试

制造的T4多核苷酸激酶不能包含RNase，外切酶或内切酶分子。制备的产品纯度应为>的95%，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和BlueSafe染色进行检测。

此外，所进行的反应酶的质量控制下面给出。

核酸内切酶

用核酸酶法检测dna酶和RNase污染。

DNase污染试验，10个单位的T4 Polynucleotide Kinase与0.2-0.3 μg超卷曲pNZY28重组质粒DNA在37°C孵育14-16小时。
在RNase污染试验中，10个单位的T4 Polynucleotide Kinase与1µg的RNA在37°C孵育1小时。

孵育后，核酸在绿色安全染色琼脂糖凝胶上观察，以检查核酸中的断裂。如果酶是纯的、高质量的，在核酸样品中不能观察到任何缺口。

末端标记

在这种方法中，DNA在进行标记反应前被去磷酸化。标记突出的5 '末端比标记钝或凹陷的5 '末端更有效。

克隆分析

在本实验中，通过将磷酸化的DNA插入非磷酸化的载体来确定T4多核苷酸激酶的活性。通过计算有多少菌落被转化来评估激酶的反应。

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多核苷酸激酶是一种参与核酸磷酸化和去磷酸化的酶。通过使核酸成为修复反应的合适底物，它在修复DNA缺口和缺口方面也起着重要作用。

由多核苷酸激酶反应产生的最终产物在分子生物学和生物化学实验室中被用于多种目的，包括寡核苷酸合成、克隆和核酸末端标记。

对于这些实验，需要一个高质量的PNK，并通过内切酶、末端标记和克隆试验来检测商业上可获得的PNK酶的质量。然而，除了高质量的试剂，高通量仪器也需要得到验证的结果和消除重复的实验。

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