液相色谱是如何工作的? Excedr是如何为您节省时间和金钱的万博全站登录

经典的色谱法使用极性固定相和非极性流动相来分离分子。然而，在反相色谱中，情况恰恰相反。也称为RPC，这种技术采用非极性固定相和极性流动相。

当样品的疏水分子，看似排斥水，处于极性流动相时，它们倾向于吸附到非极性固定相。相反，亲水性分子被水吸引，容易被水溶解，会先沿着色谱柱和洗脱液运输。

水或水缓冲液和有机溶剂的混合物在反相中被用于从反相柱中洗脱组分。梯度洗脱法是一种水-溶剂组分随时间变化的方法，常用于分离含有多种组分的样品。反相色谱法是应用最广泛的高效液相色谱法之一。

在正相色谱中，分离的基础是液相色谱的经典原理，固定相是极性的，流动相是非极性的。

一般来说，固定相通常由硅胶组成，而流动相主要是烷烃(饱和烃)或含有高比例烷烃的混合物。根据这些极性，最不极性的化合物首先洗脱，最极性的化合物最后洗脱。常规相色谱法是最古老的液相色谱法，在分离水敏感化合物、几何异构体、顺反式异构体和手性化合物方面非常有用。

离子色谱法离子交换色谱法(IEX)是一种用于从液体中分离带电粒子并测量其浓度的液相色谱技术。离子交换色谱系统可以分析粒子，如阴离子，阳离子，有机盐和蛋白质。它们通常用于环境、制造、食品、制药和化学工业。

在离子交换色谱中，固定相是由附着在聚合物树脂上的大量酸基组成的，而流动相是水相缓冲液，如溶解在适当溶剂中的无机盐。分子根据它们对离子交换器(阴离子交换器或阳离子交换器)的亲和性分离。阳离子交换层析，使用阳离子交换器，保留正电荷阳离子。相反，阴离子交换层析，使用阴离子交换器，保留负电荷的阴离子。

离子交换色谱法最常用来分离离子和极性分子，如氨基酸，大蛋白质，多肽，或几乎任何种类的带电生物分子。

在尺寸排除色谱中，样品分子与固定相之间没有化学相互作用。相反，分子的分离取决于它们的大小相对于固定相的孔径大小。最大的分子洗脱速度最快，而较小的分子(可以渗透孔隙)洗脱速度更慢。该技术也被称为凝胶渗透色谱(GPC)或凝胶过滤色谱(GF)，广泛用于分离聚合物和蛋白质。

现代高效液相色谱系统已经得到改进，可以在更高的压力下工作，因此可以在色谱柱中使用更小的颗粒尺寸(<2 μm)。这些系统被称为超高效液相色谱(UHPLC)系统，可以在120 MPa (17405 lbf/in 2)或1200个大气压下工作。术语“UPLC”是Waters公司的商标，但有时用于指UHPLC更一般的技术。

除了UHPLC，还有另一个子集的液相色谱，称为快速蛋白液相色谱(FPLC)。

FPLC通常只用于蛋白质;然而，由于树脂和缓冲液的广泛选择，它具有广泛的应用。与HPLC相比，所用的缓冲压力相对较低，通常小于5 bar，但流速相对较高，通常为1-5 ml/min。FPLC可以很容易地从总体积为5ml或更少的色谱柱中对毫克混合物的分析，到许多升色谱柱中对公斤纯化蛋白质的工业生产。

不要与FPLC混淆，市场上也有闪光色谱系统，可以最大限度地减少人在净化过程中的参与。这些系统通常被称为低压液相色谱(LPLC)系统，旨在解决高度耗时的柱层析阶段，这通常是工艺实验室生产力的瓶颈。

液相色谱泵的压力容量不同。它们的性能是根据其产生一致和可重复的流速的能力来衡量的。压力可高达60 MPa (6000 lbf/in 2)，或约600个大气压。在高效液相色谱中，泵也常被称为溶剂输送系统。它提供了一个可控的，精确的流动相和洗脱液到色谱柱的流动。

高效液相色谱泵可以提供相对无脉冲的流量对显着的反压力。即使在背压变化时，它们的流量也可重复。许多高效液相色谱泵可作为独立的模型，易于操作。也可以生成梯度洗脱。这对于HPLC和其他应用程序都很有用。

高效液相色谱泵的一些关键部件包括活塞、驱动器、泵头、高压泵单元、单向阀、比例阀、混合器、脉冲阻尼器和脱气器。目前LC系统中的许多泵包括:

• 恒压泵
• 恒流泵
• 往复泵
• 注射器泵
• Dual-piston泵
• 高压/低压混合泵

最适合您实验室需要的系统和泵取决于几个因素，最重要的是您的流速要求。

喷油器可以是单次喷射或自动喷射系统。高效液相色谱系统的进样器应提供0.1-100毫升体积范围内的液体样品或分析物的注射，并在高压下具有高重现性。

一些样品注射器可与现代高效液相色谱系统包括注射阀，样品泵，和自动进样器。在决定哪种样品注入器最适合您实验室的需要时，精度、准确度和残留通常是最重要的考虑因素。

此外，虽然手动进样阀是引入样品的最具成本效益的选择，但当需要高通量时，建议采用自动进样方法。

决定使用哪一种高效液相色谱柱进行分离取决于被分离分析物的物理性质。这些属性通常包括以下任何一种:

• 亲水/疏水性质的
• 分子间力(特别是偶极子-偶极子)
• 分子内的力量(离子)
• 大小

高效液相色谱柱分离也用于利用目标分子分子性质的特异性差异。通常，HPLC柱填料(固定相)的结构和化学性质决定了分析物的洗脱剖面。

色谱柱的尺寸从毛细管尺度到工艺尺度不等。色谱柱的内径和体积决定了色谱柱上能加载的样品体积以及分离的灵敏度。此外，色谱柱的内径会影响分离剖面，主要是在梯度洗脱时，内径越小，分离率越高，检测灵敏度越高。例如，在毛细管高效液相色谱中，小毛细血管的使用有助于色谱上更高的峰。这些较高的峰为质谱和其他浓度敏感探测器提供了更好的检测限。

在涉及分析分离的情况下，灵敏度和加载到色谱柱上的样品体积之间经常需要权衡。

传统的色谱柱由玻璃制成，而新的高效液相色谱柱主要由硼硅酸盐玻璃(一种主要由二氧化硅和三氧化二硼制成的玻璃)，丙烯酸玻璃，或不锈钢制成。这些列还可以根据分离机制进行分类。可选的栏目包括但不限于:

• 离子交换柱
• 离子排斥列
• 排除列大小
• 反相柱
• 正常阶段列

对于每一种色谱柱类型，色谱填料材料不同。此外，色谱柱恒温器通常包含在LC系统中，用于需要严密控制色谱柱温度的应用。使用恒温器的另一个优点是，通过保持柱温通常可以得到重复性更强的色谱图。有机色谱通常涉及柱加热，而分离蛋白质则相反。

高效液相色谱检测器用于检测从色谱柱中洗脱的样品混合物的组分。此外，检测器收集分离的化合物并监测它们，产生一种电子信号来识别该检测器要响应的化合物。

每种检测器类型的检测方法不同，纯度筛选产生的结果也不同。有许多检测器，每种检测器都有多种分类方法。他们通常包括:

• UV / Vis探测器:一种非破坏性的检测方法，紫外/可见探测器工作在固定或可变波长。这意味着在单个或多个波长连续测量流出物的紫外吸收。一般来说，这些设备是液相色谱中最常用的检测器。它们被认为是吸光度检测器，因为它们的设计测量了存在于洗脱液中的某一组分吸收的紫外线或可见光的量。
• 光电二极管阵列(PDA)探测器作为另一种类型的紫外/可见检测，PDA探测器可以同时检测整个光谱。
• 示差折光检测器:这种检测器也可以归类为非破坏性的，连续测量流出物的折射率。它是所有探测器中灵敏度最低的;然而，它提供了极佳的稳定性。大多数器件设计为具有温度控制结构和改进的热设计，提供更好的基线稳定性和更短的初始稳定时间。
• 荧光检测器:该探测器利用荧光光谱的原理，用设定波长的光照射出水，用单波长或多波长测量出水的荧光。它相对容易使用，并提供足够的稳定性。
• 蒸发光散射(ELSD)探测器:ELSD是一种破坏性检测方法，用于提供非挥发性分析物的灵敏读数。使用喷雾器，这个探测器不断蒸发流出物，并测量产生的气溶胶的光散射。它被认为是一种通用的检测器，用于不能用吸光度检测器分析的化合物的梯度分析。
• 电导检测器:当对溶液中的离子化合物进行分离和分析时，需要使用电导率检测器，因为任何含有离子成分的溶液都会导电。这些器件测量电子电阻，测量值与溶液中存在的离子浓度成正比。因此，在离子色谱(也称为离子交换色谱)中，通常使用电导率检测器。
• 质谱仪:当质谱仪与LC系统集成时，称为LC/MS。质谱仪的工作原理是分析现有化合物的分子量，这等于它们的质荷比(m/z)。

色谱分析，无论是HPLC、GC还是IC，都需要使用色谱数据系统(CDS)。光盘在仪器控制、数据处理、存档和报表生成中起着关键作用。

一般情况下，数据处理和仪器控制系统及其配套软件可以通过三种方式设置使用:

• 作为一个独立的系统，控制两个或多个色谱仪
• 作为一个独立的系统，维护一个色谱仪，包括LC/MS仪器
• 在一个或多个实验室中控制多个仪器的网络系统

至于HPLC系统的价格，简单的设置与基本的检测器，注入器和泵是相对实惠的。如果您选择HPLC而不是UHPLC，情况尤其如此。但是，如果增加检测模块的数量，增加自动采样器，升级为高压泵，成本会显著增加。

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