DNase:定义和概述
DNase是什么?
脱氧核糖核酸酶(DNase)核酸酶是一类核酸酶，用于切割DNA分子。它通过在核酸链两端或在核酸链之间劈裂，使双链脱氧核糖核酸(ssDNA)两个核苷酸之间形成的磷酸二酯键断裂。
这种酶由两种不同的dna酶基因编码，它们的外显子长度和数量都不同，因此有两种类型:dna酶I和dna酶II。
根据作用于基因组DNA的DNA酶的类型，它们要么产生3 '羟基端和5 '磷酸端，要么产生3 '羟基端和5 '磷酸端，反之亦然，在裂解过程后，要么产生粘性端，要么产生钝端。
此外，根据dna酶在特定位置的存在，它是分为两类：
- 细胞外DNase:在任何类型的环境样本的生物之外发现，丰富的各种栖息地，包括土壤，海洋，沉积物和淡水。
- 细胞内DNase:在生物体的细胞膜中发现的。
DNase酶对核酸序列的裂解参数不同:
- 有的在线头的任何地方切割，有的在末端裂开。
- 有的dna酶可以切割任何序列，有的则切割特定的序列。
- 有些DNA酶可以裂解双链DNA，有些则可以裂解单链DNA。
虽然DNase在执行细胞功能中有许多重要的作用，但它们的活性可以通过使用DNase抑制剂进行修改和改变。
脱氧核糖核酸酶也是实验室中必不可少的试剂之一，可以在分子生物学和生物科学中进行一系列有利可图的应用，以获得巨大的实验价值。
在这篇文章中，我们将介绍更多关于dna酶的类型，它们的应用，以及如何在实验室中测量dna酶的活性。
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类型的DNase
DNase有两种类型根据DNA底物的类型，它们的工作机制，以及裂解末端的产物。
DNase我
这种类型的dna酶是由胰腺分泌的基因DNASE1编码的内切酶。它作用于ssDNA、dsDNA和染色质。它非特异性地切割这些嘧啶核苷酸附近的分子，导致5 '磷酸端多核苷酸与一个游离的3 '羟基的形成。
该酶分为dnes1l3, dnes1l2和dnes1l1。它需要二价辅因子如Mg2+和Ca2+来执行催化功能，增强它们的酶活性。一些抑制酶的活性的抑制剂包括g -肌动蛋白，EDTA和EGTA。
DNase I的功能作用是消化细胞外核蛋白，从而减少自身免疫反应和凋亡期间的DNA碎片。酶中的任何突变都会导致DNase酶活性的逐渐降低。
在实验室中，这种酶被用于cDNA的扩增，DNA操作，以及创建DNA片段或寡核苷酸用于体外重组研究。
DNase二世
这种类型的DNase也被称为酸性DNase，其最适pH值为4.8 - 5.2，高于或低于该值其酶活性都会降低。与DNase i相比，该酶的催化功能较低。它可以同时切割dsDNA的两条链，因此也被称为nicking DNase。
这种类型的DNase不需要像Mg2+或Ca2+这样的二价辅助因子来完成它的功能，但是像锌、钙和镁这样的盐的存在会降低它的活性。此外，它们的功能也被EDTA、EGTA和G-actin like DNase I所抑制。
有两种类型的DNase II，和。除了存在于所有的人类细胞中，这种酶还存在于液体中，如睾丸液、唾液和血液中，数量很少。
DNase II α在大多数人体组织中普遍表达，并包含在溶酶体中，在机体的代谢和保护中发挥着重要作用。DNase II主要在唾液腺和眼睛中表达，它通过分裂DNA来保护晶状体免受白内障的伤害。
应用DNase
脱氧核糖核酸酶在一些实验室的分析中被用作剪刀，特别是在开发治疗严重疾病的应用。例如，它被用于治疗囊性纤维化和一些呼吸系统疾病。
基于实验的目的，DNase参与了许多测定，如体外转录、实时荧光定量PCR、mRNA衰减测定和反转录。
- 无dna RNA的制备
- 体外转录后模板DNA的去除
- 通过刻痕翻译进行DNA标记
- RNase-free足迹
- RT-qPCR和RT-PCR前制备无dna RNA
- RNA分析与体外合成(IVT)
- 微分析
- 标签抗体
- 质粒制备与纯化
- 分子克隆和DNA测序
- 了解人类和其他哺乳动物的线粒体启动子识别
市面上的无rnase脱氧核糖核酸酶通常是由研究人员为实验室应用人工创造的重组酶。例如，一些公司提供从大肠杆菌有一个牛胰腺DNase I的MBP融合克隆。
它们是为特定目的而设计的，有关信息可以在产品附带的安全数据表(SDS)、分析证书和材料安全数据表中找到。
这种酶需要适当的条件才能在实验室中发挥作用，例如:
- 1X DNase I反应缓冲液(使用10 mM Tris-HCl, 2.5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2等试剂制备，(25°C pH为7.6)。缓冲条件中的任何干扰，如NaCl或KCL盐浓度的增加，都会干扰酶的酶活性。
- 孵化在37°C
测定DNase I活性的方法
的DNA吸收的波长紫外光接近260纳米。在dsDNA中，在双链结构区域，碱基相互平行堆叠，导致分子轨道重叠，对紫外光的吸光度下降。这就是所谓的低色度效应。
同样，当双链结构发生扭曲时，碱基不再堆叠，轨道重叠减少，导致紫外吸光度增加，形成了DNAse活性的Kunitz单位的基础。
一个库尼茨单位定义为37℃下10分钟完全降解1µg质粒DNA所需的酶量。
荧光分析
这技术被广泛应用在实验室中进行高通量筛选，主要是因为涉及到多种选择的荧光团，操作简单，灵敏度高，以及各种读取模式。
然而,技术的成功在测量酶的活性取决于几个因素，包括:
- 精心选择激发(Ex)和发射(Em)波长
- 选择灵活灵敏的光学元件
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DNA酶属于一类参与DNA分子裂解的酶。它们通过破坏两个核苷酸之间的磷酸二酯键来实现。
根据它们所使用的底物、工作机制以及催化反应结束后的产物，DNase被分为两类:DNase I和DNase II。
除了它们在生物体中的代谢作用，如凋亡和保护生物体免受疾病，这些酶在实验室应用中有主要作用。
在实验室中，它们被用于克隆、测序和不同的PCR反应等分析。然而，这些分子生物学实验的成功需要不含核酸酶和蛋白酶污染物的超高纯度试剂。
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