核酸提取和纯化&我们如何为您节省时间和金钱

人工方法在很大程度上依赖于化合物的结合。由此产生的过程是非常耗时的，需要实验室技术人员在每一步都全神贯注。交叉污染的风险也会增加。此外，这些方法大多需要重复离心步骤，然后根据标本类型去除上清液，并进行额外的机械处理。

一般来说，基本的提取方法包括四个步骤:

1. 细胞裂解，以破坏细胞/组织
2. 核蛋白复合物的变性
3. RNA/DNA核酸酶的失活(RNA提取用RNase, DNA提取用DNase)
4. 避免污染

一种常见的方法是利用硫氰酸胍、苯酚、氯仿和乙醇组合分离提取目标核酸，将核酸中的蛋白质和盐杂质去除。这在整个过程中增加了多个分离和纯化步骤，如反复离心。

另一种方法涉及碱性裂解，可用于分离质粒DNA。这种方法对细菌培养(例如大肠杆菌)很有效，并使用十二烷基硫酸钠(SDS)通过覆盖硫酸盐来诱导DNA的碱性变性。离心后回收质粒DNA。

传统的提取协议和方法通常很难在常规基础上使用。由于提取和纯化是生物学研究和临床诊断的重要组成部分，所用的方法需要简化。

事实上，简化的需要导致了多种半自动化方法的发展，如固相核酸纯化，可作为提取试剂盒。

这种方法包括以旋转柱为基础的核酸纯化，这种方法可以快速地将核酸二氧化硅作为固体相进行纯化，许多制造商都有这种纯化试剂盒，这使科学家能够加快纯化过程，从而获得更有效的提取程序。它包括四个相似但简单的步骤:

1. 细胞裂解破坏细胞/组织
2. 核酸吸收
3. 清洗时避免污染
4. 洗脱

这种半自动化的方法使用各种物质进行纯化，最常用的是硅基(这些材料包括硅和玻璃颗粒以及玻璃粉末和纤维)、磁珠和阴离子交换树脂。

事实上，磁珠的使用基本上将过滤、离心和分离分为一个单独的净化步骤。

磁珠核酸纯化又称颗粒基纯化，是将目标核酸结合在磁珠上进行洗涤，最终与存在的其他核酸或杂质分离的结合-洗涤-洗脱过程。

这是利用磁分离架施加的磁场来完成的，磁分离架将结合的核酸从水溶液中残留的污染物中分离出来。它类似于硅基方法，也利用结合-洗涤-洗脱过程。

除了提纯，这些半自动化的提取过程和商业试剂盒往往遵循一系列复杂的步骤，需要类似的工作量，但产量较低，这与手工方法是常见的)。

因此，自动化的高通量系统已经被开发出来。重要的是要考虑您的实验室是否可以从这样的系统中受益。

由于赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)和凯杰(Qiagen)等制造商提供的自动化提取系统的发展，DNA提取和DNA分离的速度得到了加快。

这些系统极大地简化了整个提取过程，并允许在不需要专门培训的情况下实现高通量。事实上，这些自动化系统提供的易用性意味着您和您的团队需要接受的培训更少。

自动化系统不仅减少了工作时间和所需的人工成本，还提高了核酸提取和纯化的安全性、质量和可靠的高产率。

然而，为了与人工提取方法竞争，自动化系统必须满足几个要求:可重现的结果，最小的交叉污染，易于使用，下游检测的高质量输出，同时显著减少技术人员使用仪器的时间。

使用自动化系统有三个主要步骤:

1. 向液体样品中加入试剂
2. 将组件使用的墨盒放置在机器上
3. 开始你的过程

自动化仪器往往使用与固相核酸提取相同的试剂盒，但大大减少了完成该过程所需的时间和精力。与过去的人工方法相比，科学家们一致认为，自动化系统使核酸的提取和纯化更简单、更快和准确。

自动化系统最成功的例子是自动化液体处理程序，它通常用于许多生命科学和临床分析实验室，用于分配精确数量的样本，试剂或其他液体到指定的容器。

完全自动化的核酸提取方案已经被用于这类设备，使用固相或磁珠方法，然而，在某些情况下，高通量可能会降低总体灵敏度，因为降解的核酸目标可能会丢失。

除了手动和自动核酸提取方法之间的区别之外，还有一些其他重要的区别需要加以区分。特别是基因组DNA分离和质粒DNA分离的区别。

基因组DNA的分离需要强裂解才能将基因组DNA释放到溶液中。这意味着酶或机械的细胞膜分解被执行。如果使用酶来破坏细胞，通常使用蛋白酶K和溶菌酶。

机械击穿通常涉及到在涡流上使用珠子敲打。然后，使用氯仿提取等方法进行DNA纯化，其中苯酚/氯仿用于清洁脂质双分子层、蛋白质和其他细胞碎片。

相比之下，质粒DNA的分离通常需要轻度的碱性裂解，以便将质粒DNA连同基因组DNA一起放入溶液中。

此外，在基因组DNA分离和细胞裂解过程中，可以从脂质膜和蛋白质中纯化基因组DNA。另一方面，在分离质粒DNA时，用醋酸钾中和会将质粒DNA从基因组DNA中分离出来。

全血样本类型是获取DNA的主要来源之一，有许多不同的协议可以对这类样本进行核酸提取。